水木未來·視界iss.11丨Nature雙發(fā)！冷凍電鏡對(duì)DNA復(fù)制的認(rèn)知重塑

DNA損傷反應(yīng)（DDR）對(duì)于維持基因組的完整性至關(guān)重要。當(dāng)DNA損傷或復(fù)制應(yīng)激發(fā)生時(shí)，一個(gè)檢查點(diǎn)信號(hào)通路會(huì)被自動(dòng)激活，用于叫停細(xì)胞周期并立即啟動(dòng)對(duì)DNA損傷的修復(fù)，或在無可挽回的情況下觸發(fā)細(xì)胞凋亡。最近，來自范安德爾研究所（VAI）和洛克菲勒大學(xué)的研究人員揭示了9-1-1檢查點(diǎn)鉗(9-1-1 checkpoint clamp)這一DNA修復(fù)過程中的關(guān)鍵因子是如何作用于DNA的損傷部位的。

這些成果于3月21日發(fā)表在了《自然-結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)》雜志上，論文題目是："DNA通過與PCNA鉗相反方向的 9-1-1 DNA檢查點(diǎn)鉗加載"。

doi.org/10.1038/s41594-022-00742-6

研究人員寫道：9-1-1 DNA檢查點(diǎn)鉗被加載到DNA的5′端上，在那里它激活了阻止細(xì)胞周期的DNA損傷檢查點(diǎn)。在增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）中，加載工作通常由我們熟知的Rfc1-5完成，而9-1-1鉗是一個(gè)異源三聚體，在釀酒酵母中由Rad24-RFC（hRAD17-RFC）加載。問題就出在這里，我們不了解的Rad24取代了Rfc1的加載工作，這導(dǎo)致9-1-1鉗的加載機(jī)制一直是個(gè)謎，不同于Rfc1將PCNA加載到3′端的連接處，Rad24-RFC會(huì)將9-1-1三聚體加載到5′端的DNA連接處。為了弄清Rad24的加載機(jī)制，我們分別解析了Rad24-RFC-DNA的9-1-1鉗在完全封閉狀態(tài)和以27開啟狀態(tài)下的兩個(gè)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)工作闡明了對(duì)“細(xì)胞如何將遺傳指令從一代細(xì)胞正確傳遞給下一代”這一話題的新見解。

研究人員解釋說："DNA損傷會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果，包括癌癥和其他疾病。正因?yàn)槿绱?，我們的?xì)胞設(shè)有一系列的檢查和平衡系統(tǒng)，以確保DNA的完整性。我們解析出的9-1-1 DNA檢查點(diǎn)鉗的高分辨率結(jié)構(gòu)使得我們能夠看清它是如何與將其加載到DNA鏈上的分子相互作用的，從而詳細(xì)了解DNA修復(fù)的基本過程。我們希望這些成果能夠被用于開發(fā)與DNA損傷有關(guān)的疾病的新治療策略。"

閉合狀態(tài)9-1-1鉗的傾斜、底部和側(cè)面視圖

突出顯示了三個(gè)重要回路的位置

9-1-1鉗在開口及閉合狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)

該結(jié)構(gòu)由范·安德爾研究所的冷凍電鏡（cryo-EM）解析。解析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9-1-1 DNA鉗不是像所有其他已知的DNA鉗那樣從3'端加載到DNA上，而是從相反的一端加載到DNA上，即5'端。這一新穎和意外的發(fā)現(xiàn)解釋了為什么9-1-1可以精準(zhǔn)定位DNA的受損位置。為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)載自Science Daily: "Cryo-EM reveals how '911' molecule helps fix damaged DNA"

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于科研小組發(fā)布論文的同一天，另一篇記錄了斯隆·凱特琳研究所（SKI）的分子生物學(xué)家Dirk Remus和結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Richard Hite的合作研究成果的文章“9-1-1 檢查點(diǎn)鉗具的加載和釋放機(jī)制”也發(fā)布在了《自然-結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)》雜志上。

doi.org/10.1101/2021.09.13.460164

他們的發(fā)現(xiàn)源于兩個(gè)具有互補(bǔ)專業(yè)知識(shí)的實(shí)驗(yàn)室之間的合作。Remus博士的實(shí)驗(yàn)室使用生化方法來研究DNA復(fù)制和修復(fù)的過程。他過去幾年研究的一個(gè)主要目標(biāo)是在試管中重建DNA的整個(gè)復(fù)制和修復(fù)過程，并排除附近細(xì)胞的干擾。

通過長期的努力，Remus博士的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功純化出了修復(fù)機(jī)制的幾個(gè)部分，包括9-1-1蛋白質(zhì)和促進(jìn)9-1-1與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。

Remus博士意識(shí)到，如果能夠以原子分辨率觀察這些復(fù)合物，它們之間的相互作用將能提供修復(fù)過程中每個(gè)步驟的圖像。就是在這個(gè)時(shí)候，他向他的同事Hite博士的實(shí)驗(yàn)室尋求了幫助。Hite博士是一位結(jié)構(gòu)生物學(xué)家，擅長使用一種稱為冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）的技術(shù)，該技術(shù)能夠以原子級(jí)的分辨率對(duì)蛋白質(zhì)及其內(nèi)部的氨基酸進(jìn)行高分辨率的觀察。

Hite博士回憶道：“當(dāng)Dirk來找我們時(shí)，我們意識(shí)到我們實(shí)驗(yàn)室在過去幾年中開發(fā)的許多工具都非常適合解決他面臨的難題。通過冷凍電鏡，我們不僅能夠確定一種結(jié)構(gòu)，而且能夠確定一系列結(jié)構(gòu)。此外，借助新數(shù)據(jù)和以前的數(shù)據(jù)，我們能夠?qū)⑦@些結(jié)構(gòu)組合在一起成為模型，并提出關(guān)于該鉗具如何工作的建議?！?/p>

這場兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合進(jìn)行的結(jié)構(gòu)解析大獲成功，并給出了令人驚訝的結(jié)果：解析出的結(jié)構(gòu)模型與以前學(xué)界公認(rèn)的結(jié)論相悖。

9-1-1鉗具的形狀像一個(gè)環(huán)。為了發(fā)揮其功能，它需要將斷裂的DNA包圍在雙鏈DNA片段與單鏈DNA片段的暴露端之間的連接處。因此，9-1-1鉗的環(huán)結(jié)構(gòu)必須打開，以允許單鏈DNA擺動(dòng)到鉗的中心，然后環(huán)結(jié)構(gòu)重新閉合。這不是自發(fā)發(fā)生的，而是由另一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，即鉗具加載復(fù)合物（clamp loader complex）促進(jìn)的。

Remus博士補(bǔ)充說道："在此之前的所有研究中都認(rèn)為，鉗具將以鎖緊墊圈的方式打開，基本上鉗具的兩個(gè)開口端將旋轉(zhuǎn)出平面以產(chǎn)生狹窄的間隙，但Rich觀察到的是，9-1-1鉗具的打開范圍比預(yù)期的要大得多，并且它完全在平面上打開，并沒有像鎖緊墊圈場景中那樣的扭曲。”

鎖緊墊圈（lock-washer）

鎖緊墊圈模型認(rèn)為鉗具的兩個(gè)開口端將進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，以產(chǎn)生狹窄的間隙

科學(xué)家們指出，鎖緊墊圈模型(lock-washer model)已經(jīng)存在了二十年，并且一直是圍繞DNA加載鉗子的指導(dǎo)范式。但在這種情況下，這是錯(cuò)誤的。

Gif1: Rad24-RFC上的9-1-1在開合狀態(tài)間切換

Gif2: 9-1-1的打開過程，全程保持在平面上

Gif3: Rad24-RFC在Rad24-RFC-9-1-1的ATP綁定狀態(tài)及Rad24-RFC的ADP綁定狀態(tài)間切換。

Remus博士還認(rèn)為這項(xiàng)研究最終可能會(huì)帶來更好的抗癌藥物：許多現(xiàn)有的化療藥物通過干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制及修復(fù)過程生效。由于癌細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力已經(jīng)降低，添加破壞DNA的化療藥物會(huì)壓倒細(xì)胞修復(fù)DNA的能力，并導(dǎo)致它們死亡，例如PARP抑制劑。大膽猜想，也許發(fā)現(xiàn)9-1-1的工作原理能讓我們設(shè)計(jì)出更多對(duì)DNA復(fù)制及修復(fù)過程進(jìn)行靶向干預(yù)的藥物。

轉(zhuǎn)載自News Medical: "Researchers offer a clear picture of how the 9-1-1 clamp is recruited to sites of DNA damage"

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